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Les données de toxicité aigues indiquent que le 2,4-D n'est pas très toxique par les différentes voies d'exposition. Il n'est pas irritant pour la peau mais la forme diméthylamine est un irritant oculaire sévère. Le 2,4-D n'est pas un sensibilisant cutané.

Après une exposition orale au 2,4-D à des doses supérieures au seuil de saturation de la clairance rénale, des effets toxiques sont observés chez le rat sur les reins principalement, la thyroïde et le foie, notamment des modifications du poids des organes, des paramètres biochimiques cliniques et des taux hormonaux, ainsi que des altérations histopathologiques. D'autres organes sont également touchés par des effets sur le poids des organes et altérations histopathologiques (ex. glandes surrénales, testicules, ovaires). L’exposition répétée (par voie orale, permet au 2,4-D de s'accumuler dans les tubules rénaux proximaux par l'action d'un transporteur d'anions organiques rénaux saturable et métaboliquement actif.

L’EPA a classé le 2,4-D comme « non classifiable en termes de cancérogénicité pour l'humain », sur la base de tests biologiques effectués sur des rats et des souris qui n'ont montré aucune réponse tumorale statistiquement significative chez l'une ou l'autre espèce. Une revue systématique de la littérature a également été réalisée par l'Agence américaine axée sur les effets cancérigènes afin de s'assurer que l'évaluation de la cancérogénicité du 2,4-D tenait compte de toutes les données scientifiques pertinentes disponibles à ce jour. L'examen épidémiologique a révélé que, dans l'ensemble, il y avait peu de preuves substantielles suggérant une relation associative ou causale claire entre l'exposition au 2,4-D et le cancer.

Les preuves de la génotoxicité du 2,4-D sont faibles, mais il pourrait causer une certaine neurotoxicité en particulier à des doses élevées dépassant le seuil de saturation de la clairance rénale. Pour ce qui est des effets sur la reprocuction et le développement, Il existe une indication d'une susceptibilité accrue dans l'étude de toxicité sur le développement chez le rat et dans l'étude de reproduction sur deux générations chez le rat. Cependant, des effets rénaux auraient été attendus chez la mère si un examen rénal avait été effectué dans le cadre de ces études.Cela laisse un doute (d'où le classement de données insuffisantes), mais les résultats ne sont pas considérés comme une preuve de sensibilité. Concernant une potentielle perturbation endocrinienne, la conclusion de l'évaluation du poids de la preuve est que le 2,4-D ne présente aucune preuve convaincante d'une interaction potentielle avec les voies œstrogéniques, androgéniques ou thyroïdiennes.

Le 2,4-D sous forme de sel de diméthylammonium est faiblement toxique chez les poissons et les invertébrés aquatiques d'eau douce. Lemna gibba, une plante vasculaire aquatique, est sensible à cet herbicide. Le log P du 2,4-D acide indique qu'il a un faible potentiel de bioaccumulation.

Le 2,4-D sous forme de sel de diméthylammonium est faiblement toxique chez les oiseaux avec une DL50 aiguë supérieure à 4 640 mg/kg pc chez le canard colvert.

Cet herbicide est faiblement toxique chez les abeilles avec une DL50 aiguë par contact supérieure à 100 µg/abeille.