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Le pydiflumétofène présentait une faible toxicité aiguë par les voies orale et cutanée et par inhalation chez le rat. Il n’a provoqué qu’une irritation oculaire minime et aucune irritation cutanée chez le lapin. Les résultats d’un essai sur des ganglions lymphatiques locaux (LLNA) de souris ont également montré qu’il n’est pas un sensibilisant cutané. La préparation commerciale fongicide A21461 présentait une toxicité aiguë modérée chez le rat par la voie orale et une toxicité aiguë faible chez le rat par voie cutanée et par inhalation. Chez le lapin, elle causait une irritation oculaire modérée et une irritation cutanée minime.

Les études de toxicité par le régime alimentaire avec doses répétées de pydiflumétofène chez la souris, le rat et le chien ont révélé que l’organe ciblé était le foie. Une diminution de poids corporel et de consommation alimentaire était fréquemment observée. La durée de l’étude avait une incidence sur la toxicité, car les effets toxiques étaient généralement observés aux doses plus faibles dans les études à long terme. Aux doses plus faibles, les résultats observés sur le foie, notamment l’augmentation du poids du foie, ont été jugés non nocifs, mais on a constaté une progression des effets toxiques avec l’augmentation de la dose. Généralement, l’augmentation du poids du foie s’accompagnait d’hypertrophie hépatocellulaire et d’altérations chimiques et cliniques, comme une augmentation du cholestérol, de la phosphatase alcaline et des triglycérides. À la suite d’une exposition par le régime alimentaire à long terme chez le rat, on a observé chez les deux sexes une diminution du poids corporel, de la prise de poids corporel, de la consommation alimentaire et de l’efficacité alimentaire. Aucun signe d’oncogénicité n’a été observé dans cette étude. On a également observé des effets hépatocellulaires. 

Chez les souris mâles, on a observé une fréquence accrue des adénomes et des carcinomes hépatiques combinés à la dose élevée. Le nombre de souris présentant des adénomes et des carcinomes hépatiques aux doses faibles et moyennes était à l’intérieur des plages des données historiques se rapportant aux témoins. Cependant, on a constaté une augmentation statistiquement significative du nombre de souris présentant de multiples adénomes hépatiques aux doses moyennes et élevées. À la dose élevée, on a observé des souris atteintes de carcinomes hépatiques multiplesDû à l’incompatibilité entre les termes utilisés par l’EPA et la méthodologie utilisée dans SAgE pesticides pour la classification du potentiel cancérigène, une évaluation a été réalisée de manière indépendante sur la base des lignes directrices pour l’évaluation des risques liés aux agents cancérigènes de l’EPA et à l’aide de l’étude de données supplémentaires lorsque disponibles. Enfin, la dose moyenne a été considérée comme dose tumorigène en raison du nombre accru de mâles présentant des adénomes hépatiques multiples. 

Le pydiflumétofène ne causait pas d’effet sur le développement chez le rat ou le lapin, et ne provoquait pas d’effet nocif sur la reproduction du rat. Il n'est pas considéré génotoxique et il ne cause pas de perturbation endocrinienne. Même si le pydiflumétofène a causé quelques effets chez la femelle dans une étude de neurotoxicité aiguë chez le rat, il n’était pas sélectivement neurotoxique.

Le pydiflumétofène est toxique pour les poissons d'eau douce (CL50 - 96 h de 186 µg/L chez la truite arc-en-ciel) et les invertébrés aquatiques d’eau douce (CE50 – 48 h de 421 µg/L pour Daphnia magna). Il est modérément toxique pour les algues vertes (CE50 - 96 h de 1 500 µg/L pour Raphidocelis subcapitata) et les plantes vasculaires (CE50 – 7 jours > 6 300 µg/L pour Lemna gibba).

Le pydiflumétofène est faiblement toxique chez les oiseaux exposés par voie orale (DL50 > 2000 mg/kg p.c. chez le colin de Virginie).

Ce fongicide est faiblement toxique chez les abeilles (DL₅₀ par voie orale > 116 µg/abeille et DL₅₀ par contact > 100 µg/abeille).